HLA-A0201限制性抗AFP抗原特異性CTL的制備方法技術

本發明專利技術屬于生物技術開發與應用研究領域，公開了HLA-A0201限制性抗AFP抗原特異性CTL的制備方法。該方法通過單采收集外周單個核細胞，富集純化CD8+T淋巴細胞；用負載HLA-A0201限制性AFP抗原多肽的成熟樹突狀細胞刺激CD8+T淋巴細胞，用rhIL-2和rhIL-7聯合促進T細胞生長；用Tetramer標記方法和流式細胞分選術純化目標CTL；用固相包被的抗人CD3單抗和IL-2刺激目標CTL的生長；加γ射線輻照后的自體PBMC增強目標CTL的活化；加rhIL-15培育擴增，收集鑒定。本方法制備的目標CTL具備高純度，高增殖能力，高殺傷活性，高比例CTL-CM，用于腫瘤等免疫治療。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物技術開發與應用研究領域，涉及HLA-A0201限制性抗AFP抗原特異性CTL制備方法。
技術介紹
一、腫瘤治療的困境與機會惡性腫瘤已成為人類第一號“殺手”，手術、放療與化療是治療腫瘤的三大常規方法，能在短期內有效的減輕腫瘤負荷，但仍不能有效清除腫瘤細胞。微小殘留病灶、對放療、化療的部分敏感和耐藥是腫瘤復發及轉移的根源，而復發與轉移正是腫瘤患者死亡的主要原因。常規治療方法已力不從心，開發新型的腫瘤治療技術與產品迫在眉睫。二、細胞免疫治療技術的誕生與發展上世紀80年代起免疫學與腫瘤學的迅速發展，1982年美國NIHRosenberg教授為首的研究小組研制出淋巴因子活化的殺傷細胞(LAK)免疫療法，并在后續研究中對LAK細胞的臨床應用進行了深入的探討。但是LAK細胞殺傷力不夠強，臨床應用需要大量輸注(3×1010-11)，另一方面擴增能力有限，需要在輸注細胞的同時大劑量應用白細胞介素-2(IL-2)(10萬IU/kg，q8h)，因而產生了相關的不良反應。而后Rosenberg又提出了腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，其殺瘤能力較LAK有了明顯提高，并且無需大劑量IL-2聯合應用，但細胞需要從腫瘤組織中分離獲得，這極大限制其廣泛的臨床應用。在以上的工作基礎上，1991年Stanford大學的Schmidt-Wolf等采用干擾素γ(IFN-γ)、IL-2和鼠抗人CD3單克隆抗體(Mouseanti-HumanCD3mAb)共同誘導出了具有強大抗腫瘤活性的細胞群，命名為細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)。樹突狀細胞(DCs)是迄今為止已知的體內功能最為強大的專職抗原遞呈細胞(APC)，其表面存在豐富的抗原捕獲分子，抗原遞呈分子(MHCI類和MHCⅡ類分子)，免疫共刺激分子(CD80、CD83、CD86、CD40等)。經抗原刺激后的DC細胞向淋巴結遷移，將其攜帶的抗原信息傳遞給相應的T淋巴細胞，啟動、激發CD4+/CD8+T細胞免疫應答，特異性地殺滅腫瘤細胞。同時經抗原刺激后的DCs可分泌白細胞介素-8(IL-8)、干擾素α(IFN-α)、白細胞介素-12(IL-12)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等，增強機體非特異性免疫應答(天然免疫)，故DC有“天然免疫佐劑”的美稱，其發現者RalphSteinman教授獲得2011年諾貝爾醫學獎。鑒于DC在機體免疫防御系統中所處的中心地位，基于DC開發的抗腫瘤疫苗已使之成為最先進、最有希望的腫瘤免疫治療技術之一，近年來國內外學者對其進行了廣泛的探索。1992年Stanford醫學院的2位教授成立了世界上第一家以DC為基礎的腫瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，該公司的產品Provenge已于2010年4月29日獲得FDA批準上市。但是DC在體內的功能受到患者本身免疫狀態，腫瘤微環境的影響，而腫瘤患者體內存在大量抑制因子，因此DC的體內效果并不如體外效果理想。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)構建是近期興起的免疫治療技術，因其具有特異、直接殺傷腫瘤靶細胞的能力，因此成為研究的熱點。三、甲胎蛋白(AFP)在腫瘤免疫治療中的作用甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是1965年首次在2例原發性肝癌患者中被發現的，人類的AFP屬于α球蛋白，電泳運動在白蛋白與球蛋白之間，分子量約為64,000—72,000，沉淀系數為4.5。此蛋白約有18種氨基酸組成，碳水化合物約占4％。AFP是嚙齒類動物胚胎期和人胚胎期血清中的主要蛋白成分。人類胚胎在宮內發育的第六周左右用雙向擴散法即能測出AFP，到第13周左右可達到高峰，第16周后AFP的濃度迅速下降而白蛋白濃度上升。在人類胚胎中AFP最高濃度可達3-4mg/ml，但新生兒期其血清濃度約為10-50ug/ml，出生后第1周末用雙向擴散法即不再能測出。在成人，AFP可以在大約80％的肝癌患者血清中升高，在生殖細胞腫瘤出現AFP陽性率為50％。在其它腸胃管腫瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出現不同程度的升高。當肝細胞發生癌變時，卻又恢復了產生這種蛋白質的功能，而且隨著病情惡化它在血清中的含量會急劇增加，甲胎蛋白就成了診斷原發性肝癌的一個特異性臨床指標。AFP抗原高表達的肝癌惡性度高、病情進展快，病人早期一般沒有什么不適，一旦出現癥狀就診，往往已屬中晚期。故治療難度大、療效差，一般發病后生存時間僅為6個月，人稱“癌中之王”。而目前還未有針對AFP抗原的藥物上市，因此開發新型針對AFP靶點的藥物勢在必行。抗AFP特異性CTL的開發是一種發展方向。四、CTL作用機理1、機體T細胞免疫反應過程機體存在龐大的T細胞庫，通過其表面表達不同的T細胞受體(TCR)特異識別不同的外部抗原分子(細菌、病毒和腫瘤抗原多肽)，被活化為具有殺滅靶細胞的CTL，清除細菌、病毒的感染和腫瘤細胞，且能產生免疫記憶性CTL，防止細菌、病毒的再次入侵和腫瘤的復發。CTL免疫應答大致分四個階段：(1)抗原識別：APC通過表面受體識別并捕獲抗原(細菌、病毒、腫瘤細胞)；(2)抗原加工與遞呈：抗原經APC消化、裂解成多肽分子，后者與APC胞內豐富的MHC-Ⅰ類或Ⅱ類分子結合分別形成MHC-I-多肽或MHC-II-多肽復合物，并被轉運至APC表面；(3)T細胞激活(雙信號學說)：APC與T細胞相遇，T細胞通過自身TCR識別APC遞呈的MHC-I/II-多肽復合物，其中CD8+T細胞識別MHC-I-多肽復合物，CD4+T細胞識別MHC-II-多肽復合物，T細胞接受了抗原的刺激信號(第一信號)加上免疫共刺激信號(第二信號)開始活化，具有細胞毒性作用即CTL；(4)靶細胞殺滅：活化CTL循環至抗原所在部位，通過CTL表面的TCR特異識別抗原表達細胞后進行殺傷和清除。但，已發現腫瘤患者體內存在大量免疫抑制因子，影響CTL的有效活化和增殖，數量甚少，不足以與迅速增殖的腫瘤抗衡。若能在體外制備大量抗原特異性CTL并回輸給患者，可直接、快速殺傷腫瘤細胞起到治療作用，對常規治療無法清除的殘留腫瘤細胞進行殺滅，將可以防止腫瘤的復發和轉移。2、CTL表型與功能差異根據CTL表面分子的表達種類可分為兩型：中央記憶型CTL(CTL-CM)和效應記憶型CTL(CTL-EM)。Klebanoff等研究發現：表型分析為CD3+CD45RO+CD62L+CCR7+的CTL-CM具有更強的抗腫瘤能力；Johnson等比較了MART-1TCR基因修飾的CTL-CM和CTL-EM，結果發...

【技術保護點】
HLA?A0201限制性抗AFP抗原特異性CTL制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟：a.CTL前體細胞來源細胞的富集與純化：單采收集外周單個核細胞作為CTL前體細胞來源；采用臨床級陰性磁珠分離法，從收集外周單個核細胞中富集、純化CTL前體細胞即CD8+T淋巴細胞；b.目標CTL誘導與第一輪擴增：用負載HLA?A0201限制性AFP抗原多肽的成熟樹突狀細胞刺激CD8+T淋巴細胞，同時加入rhIL?2和rhIL?7兩種細胞因子聯合促進T細胞生長；第二周再重復刺激一次，完成第一輪擴增；c.目標CTL純化方法：采用Tetramer標記方法和流式細胞分選術純化目標CTL，即選擇Tetramer+CD8+T淋巴細胞；d.目標CTL第二輪擴增：采用固相包被的anti?human?CD3mAb和rhIL?2刺激目標CTL的生長；加入經γ射線輻照后的自體外周單個核細胞增強對目標CTL的活化；加入rhIL?15繼續培育，完成第二輪擴增，收集鑒定。

【技術特征摘要】
1.HLA-A0201限制性抗AFP抗原特異性CTL制備方法，其特征在于該方法包括下
列步驟：
a.CTL前體細胞來源細胞的富集與純化：
單采收集外周單個核細胞作為CTL前體細胞來源；采用臨床級陰性磁珠分離法，
從收集外周單個核細胞中富集、純化CTL前體細胞即CD8+T淋巴細胞；
b.目標CTL誘導與第一輪擴增：
用負載HLA-A0201限制性AFP抗原多肽的成熟樹突狀細胞刺激CD8+T淋巴細胞，
同時加入rhIL-2和rhIL-7兩種細胞因子聯合促進T細胞生長；第二周再重復刺激一次，
完成第一輪擴增；
c.目標CTL純化方法：
采用Tetramer標記方法和流式細胞分選術純化目標CTL，即選擇Tetramer+CD8+T
淋巴細胞；
d.目標CTL第二輪擴增：
采用固相包被的anti-human-CD3mAb和rhIL-2刺激目標CTL的生長；加入經γ射
線輻照后的自體外周單個核細胞增強對目標CTL的活化；加入rhIL-15繼續培育，完成
第二輪擴增，收集鑒定。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟b中HLA-A0201限制性AFP
抗原多肽長度為9-15個氨基酸。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的HLA-A0201限制性AFP抗
原多肽序列如SEQIDNO.1所示。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟b中負載HLA-A0201限制性
AFP抗原多肽的成熟樹突狀細胞是通過下列方法制備得到的：將外周單個核細胞貼壁后
加入含rhGM-CSF、rhIFNα、滅活的混合正常人AB血清和RPMI1640培養基培養三天，
收獲DC再加入目標抗原孵育即得...

【專利技術屬性】
技術研發人員：時宏珍，
申請(專利權)人：時宏珍，
類型：發明
國別省市：江蘇;32